iFluor 720琥珀酰亚胺酯

	货号	1046	存储条件	在零下15度以下保存, 避免光照
	规格	1 mg
	Ex (nm)	716	Em (nm)	740
	分子量	1089.29	溶剂	DMSO
	产品详细介绍

简要概述

iFluor 720琥珀酰亚胺酯是iFluor系列荧光标记染料之一，可以覆盖整个可见光谱。所有iFluor 染料都具有优异的水溶性，它们的亲水性使有机溶剂的使用极小化。与常规的染料(如FITC，TRITC，Texas Red ，Cy3 ，Cy5和Cy7)相比，iFluor 染料具有更好的标记性能。一些iFluor 染料在某些抗体上明显优于Alexa Fluor 标记染料。它们是用于标记蛋白质和核酸的极便宜的荧光染料（替代Alexa Fluor 染料）。每种iFluor染料的开发都与特定的Alexa Fluor 或其他标记染料（如DyLight 染料）的光谱特性相匹配。

琥珀酰亚胺基（NHS）酯被证明是用于胺修饰的极佳试剂，因为形成的酰胺键基本上与天然肽键相同并且稳定。这些试剂通常是稳定的并且与脂族胺显示出良好的反应性和选择性。当琥珀酰亚胺酯化合物用于缀合反应时，需要考虑的因素很少：1.溶剂：在大多数情况下，活性染料应溶于无水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO）中。 2.反应pH：胺与琥珀酰亚胺酯的标记反应强烈依赖于pH。胺反应性试剂与非质子化脂族胺基团反应，包括蛋白质的末端胺和赖氨酸的β-氨基。因此，胺酰反应通常在pH 7.5以上进行。被琥珀酰亚胺酯修饰的蛋白质是具有代表性的，通常在pH 8.5-9.5下合成。 3.反应缓冲液：使用胺反应试剂时，必须避免使用含有游离胺（如Tris和甘氨酸）和硫醇化合物的缓冲液。广泛用于蛋白质沉淀的铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）也必须在进行染料缀合之前除去（例如通过透析）。 4.反应温度：大多数缀合在室温下进行。特定标记反应可能需要升高或降低的温度。iFluor系列染料是AF系列染料的替代品。

 

产品说明书

染色样本分析

溶液配制

1.蛋白质原液配制（溶液A）

将100μL反应缓冲液（如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液，pH~9.0）与900μL目标蛋白溶液（如抗体，蛋白质浓度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL，再加入1 mL蛋白质标记原液。

注1：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注2：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。

注3：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得极佳标记结果。

注4：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，则结合效率会显着降低。为获得极佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

2.iFluor 720琥珀酰亚胺酯原液配制

将无水DMSO加入到iFluor 720 SE小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

注意：在开始缀合前准备染料储备溶液（溶液B），及时使用。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周，避光保存。 避免冻融循环。

 

操作步骤 

该标记方案是为山羊抗小鼠 IgG 与 iFluor 720 SE 的结合而开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。 注意 每种蛋白质需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的特性。蛋白质的过度标记会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。 

1.进行缀合反应：

1.1使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比作为起点：将 5 µL 染料储备溶液（溶液 B，假设染料储备溶液为 10 mM）添加到蛋白质小瓶中溶液（95 µL 溶液 A）有效摇动。假设蛋白质浓度为 10 mg/mL 且蛋白质的分子量为 ~200KD，则蛋白质的浓度为 ~0.05 mM。

注意：我们建议使用 10:1 摩尔比的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）。如果太低或太高，分别确定染料/蛋白质比例为 5:1、15:1 和 20:1。

1.2在室温下继续旋转或摇动反应混合物 30-60 分钟。

 

2.纯化缀合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 - 蛋白质缀合物的实例。

2.1按照制造说明准备Sephadex G-25色谱柱。

2.2将反应混合物（直接从步骤4）加载到Sephadex G-25柱的顶部。

2.3样品在顶部树脂表面下方运行时立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

2.4向所需样品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色谱柱纯化。

注1：立即使用时，染料 - 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。

注2：对于长期储存，染料 - 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 

References

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